逆转座子可以将新基因插入基因组中的“安全港”，补充 CRISPR 基因编辑。最近，CRISPR-Cas9 治疗镰状细胞病的获批凸显了基因编辑技术在抑制基因活性以治疗遗传疾病方面的有效性。然而，将整个基因整合到人类基因组中以替代有缺陷或有害基因的能力仍然无法实现。
一种利用鸟类的逆转录转座子将基因插入基因组的新技术为基因治疗带来了更大的希望，因为它将基因插入人类基因组的“安全港”，在那里插入不会破坏必需基因或导致癌症。
逆转座子或逆转录元件是片段，当它们转录为RNA时，会编码酶，将 RNA 复制回基因组中的 DNA 中——这是一个自私的循环，会用逆转座子 DNA 弄乱基因组。大约 40% 的人类基因组是由这种“自私的”新 DNA 组成的，尽管大多数基因都是无功能的，即所谓的垃圾 DNA。
这项新技术名为精准 RNA 介导的转基因插入 (PRINT)，利用一些逆转录转座子的能力，高效地将整个基因插入基因组，而不会影响其他基因组功能。PRINT 将补充 CRISPR-Cas 技术公认的功能，使基因失活、产生点突变和插入短片段 DNA。
细胞生物学教授凯瑟琳·柯林斯 (Kathleen Collins) 实验室开发，其描述最近发表在《自然生物技术》杂上。
PRINT 涉及将新 DNA 插入细胞
使用的方法类似于将 CRISPR-Cas9 运送到细胞中 美国数据中的电话号码列表 进行基因组编辑的方法。对于 PRINT，一段被递送的 RNA 编码一种常见的逆转录元件蛋白，称为 R2 蛋白，该蛋白具有多个活性部分，包括切口酶（一种结合和切口双链 DNA 的酶）和逆转录酶（一种产生 RNA 的 DNA 拷贝的酶）。柯林斯说，另一种 RNA 是要插入的转基因 DNA 的模板，加上基因表达控制元件（R2 蛋白插入基因组的整个自主转基因盒）。
使用 R2 蛋白的一个关键优势是，它将转基因插入基因组中含有数百个相同基因拷贝的区域——每个拷贝都编码核糖体 RNA，即将信使 RNA (mRNA) 翻译成蛋白质的 RNA 机器。由于有如此多的冗余拷贝，当插入破坏一个或几个核糖体 RNA 基因时，基因的丢失不会被忽略。
将转基因放入安全港避免了通过人类病毒载体插入转基因时遇到的一个主要问题，这是当今的常用方法：基因经常被随机插入基因组，导致工作基因失效或干扰基因的调控或功能，从而可能导致癌症。
“基于 CRISPR-Cas9 的方法可以修复突变核苷酸或插入一小段 DNA — 序列修复。或者，你可以通过位点特异性诱变来敲除基因功能，”担任 Walter and Ruth Schubert 家族主席的 Collins 说道。“我们不会敲除基因功能。我们不会修复内源性基因突变。我们采用互补方法，即将一个自主表达的基因放入基因组中，该基因会产生活性蛋白质 — 以添加功能性基因作为缺陷旁路。这是转基因补充，而不是突变逆转。对于修复由同一基因的大量个体突变引起的功能丧失疾病，这很棒。”
真正的赢家是鸟类
许多遗传性疾病，如囊性纤维化和血友病，都是 以及哪些来源有由同一基因的多种不同突变引起的，这些突变都会使基因失去功能。任何基于 CRISPR-Cas9 的基因编辑疗法都必须针对患者的具体突变进行量身定制。使用 PRINT 进行基因补充可以将正确的基因传递给每个患病的人，让每个患者的身体都能制造正常的蛋白质，无论最初的突变是什么。
许多学术实验室和初创公司正在研究使用转座子和逆转录转座子插入基因用于基因治疗。生物技术公司正在研究的一种流行的逆转录转座子是 LINE-1（长散布元件-1），它在人类中已经复制了自身和一些搭便车基因，覆盖了大约 30% 的基因组，尽管我们基因组的 LINE-1 逆转录转座子副本中只有不到 100 个副本具有功能，这只占基因组的极小部分。
12 月 14 日，柯林斯与加州大学伯克利分校的博士后同事 Akanksha Thawani 以及加州大学伯克利分校分子与细胞生物学系杰出教授兼霍华德休斯医学研究所研究员 Eva Nogales 在《自然》杂志上发表了 LINE-1 逆转录因子编码的酶蛋白的低温电子显微镜结构。
柯林斯说，这项研究清楚地表明，LINE-1 逆转座子蛋白很难被改造，无法安全有效地将转基因插入人类基因组。但之前的研究表明，插入基因组的重复核糖体 RNA 编码区 (rDNA) 的基因可以正常表达，这让柯林斯认为，另一种名为 R2 的逆转座子可能更适合安全地插入转基因。
由于人类中没有发现 R2，柯林斯与加州大学伯克利分校的高级研究员张晓竹和博士后研究员布里亚纳·范·特里克从二十多种动物基因组（从昆虫到鲎和其他多细胞真核生物）中筛选了 R2，以找到一个高度针对人类基因组中 rDNA 区域、并能高效将长 DNA 插入该区域的版本。
“在追逐了数十只鸟之后，真正的赢家是鸟类，”柯林斯说，其中包括斑胸草雀和白喉麻雀。
尽管哺乳动物的基因组中没有 R2，但它们确实具有 R2 作为逆转录元件有效插入所需的结合位点——她说，这可能是一种迹象，表明哺乳动物的前身有一个类似 R2 的逆转录元件，但不知何故被踢出了哺乳动物基因组。
在实验中，张和范·特里克合成了编码 R2 蛋白的 mRNA 和模板 RNA，后者将产生一个转基因，该转基因含有由 RNA 聚合酶启动子表达的荧光蛋白。这些 RNA 被共转染到培养的人类细胞中。在激光照射下，约有一半的细胞因荧光蛋白表达而发出绿光或红光，表明 R2 系统已成功将有效的荧光蛋白插入基因组。
进一步的研究表明，转基因确实插入了基因组的 rDNA 区域，并且可以插入大约 10 个 RNA 模板拷贝，而不会破坏 rDNA 基因的蛋白质制造活性。
一个巨大的核糖体生物合成中心
将转基因插入基因组的 rDNA 区域除了为它们 bzb 目录 提供安全港之外，还有其他好处。rDNA 区域位于五条独立染色体的短臂上。所有这些短臂挤在一起形成一个称为核仁的结构，DNA 在核仁中转录成核糖体 RNA，然后折叠成制造蛋白质的核糖体机制。在核仁内，rDNA 转录受到严格调控，基因会快速修复，因为任何 rDNA 断裂如果任其传播，都可能停止蛋白质生产。因此，插入基因组 rDNA 区域的任何转基因都会在核仁内得到小心翼翼的处理。
“核仁是一个巨大的核糖体生物合成中心，”柯林斯说。“但它也是一个非常优越的 DNA 修复环境，基因插入的致癌风险很低。这些成功的逆转录因子——我将它们拟人化了——已经进入核糖体 DNA，这真是太棒了。它是多拷贝的，是保守的，它是一个安全港，因为你可以破坏其中一个副本，而细胞不会在意。”
这使得该地区成为植入人类基因治疗基因的理想场所。
Collins 承认，R2 的工作原理仍有很多未知之处，而且 rDNA 转录的生物学原理也存在问题：有多少 rDNA 基因可以在细胞注意到之前被破坏？由于某些细胞会关闭人类基因组中 400 多个 rDNA 基因中的许多基因，这些细胞是否更容易受到 PRINT 副作用的影响？她和她的团队正在研究这些问题，同时也在调整与逆转录插入相关的各种蛋白质和 RNA，以使 PRINT 在培养细胞和来自人体组织的原代细胞中更好地发挥作用。
但最重要的是“它是有效的”，她说。“只是我们必须对 rDNA 的生物学特性有更多的了解，才能真正利用它。”
